可生物降解的級(jí)聯(lián)納米催化劑用于腫瘤微環(huán)境重構(gòu)，實(shí)現(xiàn)可控的CO釋放和腫瘤靶向/協(xié)同治療

文章標(biāo)題：Biodegradable cascade nanocatalysts enable tumor-microenvironment

remodeling for controllable CO release and targeted/synergistic cancer nanotherapy

第一作者：Jianrong Wu

通訊作者：Xiaojun Cai，Yu Chen, and Yuanyi Zheng

通訊單位：上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院，上海大學(xué)

論文導(dǎo)讀：

氣體療法作為一種新興的腫瘤治療方式，由于其低的毒副作用，具有廣闊應(yīng)用前景的治療策略。然而這種治療模式仍面臨著諸多挑戰(zhàn)，如治療性氣體的精確遞送和可控釋放。針對(duì)這一挑戰(zhàn)，上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院鄭元義教授、蔡曉軍副研究員和上海大學(xué)陳雨教授等合作報(bào)道了一種級(jí)聯(lián)生物可降解納米催化劑介導(dǎo)的原位持續(xù)釋放CO氣體和磁共振成像監(jiān)測(cè)的靶向/協(xié)同腫瘤氣體/饑餓納米治療的“腫瘤微環(huán)境重塑”策略。該納米催化劑通過(guò)將葡萄糖氧化酶（GOD）和H2O2敏感分子羰基錳（MnCO）包裹在可生物降解的中空介孔有機(jī)硅納米粒子中制備而成。GOD首先作為介孔氧化硅的“開(kāi)關(guān)”，隨后修飾靶向多肽（cRGD）用于特異性靶向αvβ3整合素過(guò)表達(dá)的腫瘤細(xì)胞。在腫瘤微酸性的情況下，GOD被解離，釋放負(fù)載的MnCO前藥。前藥在H2O2的條件下原位釋放CO氣體。同時(shí)，GOD催化腫瘤細(xì)胞內(nèi)葡萄糖分解產(chǎn)生葡萄糖酸和H2O2來(lái)重塑腫瘤微環(huán)境，進(jìn)一步促進(jìn)CO/Mn2+的原位生成。通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)異位腫瘤模型驗(yàn)證表明：納米催化劑通過(guò)協(xié)同CO氣體和饑餓納米治療，可以獲得了優(yōu)越的治療性能。本研究為通過(guò)重塑腫瘤微環(huán)境增強(qiáng)CO介導(dǎo)的抗腫瘤療效提供了一種新的策略。

研究進(jìn)展：

在這項(xiàng)工作中，研究人員設(shè)計(jì)了一種智能的靶向/級(jí)聯(lián)納米催化劑（RGD-GOD-MnCO@HMONs，縮寫為RG-Mn@H） 重構(gòu)TME，實(shí)現(xiàn)CO氣體的原位可控釋放。構(gòu)建的級(jí)聯(lián)納米催化劑可在磁共振（MR）引導(dǎo)下用于協(xié)同腫瘤饑餓治療與CO氣體治療（圖一）。在TME中，通過(guò)GSH誘導(dǎo)的二硫鍵斷裂和pH誘導(dǎo)的亞胺鍵水解打開(kāi)GOD門衛(wèi)，繼而使得HMONs的快速生物降解，導(dǎo)致負(fù)載MnCO的釋放，MnCO進(jìn)一步與內(nèi)源性H2O2和H+反應(yīng)以實(shí)現(xiàn)CO氣體的按需釋放。隨后，釋放的GOD催化葡萄糖生成葡萄糖酸和H2O2。這一過(guò)程不僅切斷了細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，而且通過(guò)H+和H2O2富集的TME的重構(gòu)，加速了MnCO的分解，提高了CO的生成。同時(shí)，基于釋放出的順磁性Mn2+離子，磁共振T1加權(quán)成像也可以監(jiān)測(cè)治療過(guò)程。該方法在體外和體內(nèi)都得到了系統(tǒng)的評(píng)價(jià)和驗(yàn)證。

圖一 靶向級(jí)聯(lián)納米催化劑（RG-Mn@H）的設(shè)計(jì)及其用于TME的重構(gòu)，引發(fā)連續(xù)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的示意圖

首先，該團(tuán)隊(duì)采用“氨水輔助選擇性蝕刻”方法合成具有二硫鍵摻雜/結(jié)合的HMON框架。通常，核/殼SiO2@MONs在三乙醇胺存在下制備。用氨水溶液選擇性地刻蝕SiO2核，形成空心納米結(jié)構(gòu)。透射電子顯微鏡（TEM）圖像顯示，獲得的HMON具有均勻的空心球形拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，粒徑約為55 nm（圖二a）。相應(yīng)的能譜分析顯示了C、S、Si和O元素的分布。基于29Si魔角自旋（MAS）和13C交叉極化MAS（CPMAS）固態(tài)NMR譜的HMONs組成分析證實(shí)HMONs中存在二硫鍵雜化的倍半硅氧烷骨架（圖二b和c），當(dāng)MnCO封裝后，HMONs-CHO的Zeta電位變?yōu)?16.2 mV（圖二d）。從Mn@H-CHO的紫外-可見(jiàn)光譜可以看出（圖二e），在340 nm處發(fā)現(xiàn)MnCO的顯著吸收，證實(shí)了有效的MnCO封裝，其負(fù)載效率為37.5%（w/w%）。GOD作為門控開(kāi)放，通過(guò)形成pH敏感的亞胺共價(jià)鍵與HMONs-CHO結(jié)合，從而得到一種新的納米催化劑，GOD-MnCO@HMONs （G-Mn@H）. 同時(shí)，進(jìn)一步修飾RGD形成最終產(chǎn)物RG-Mn@H 納米催化劑。TEM圖像（圖二f）顯示了RG-Mn@H獨(dú)特的球形結(jié)構(gòu)，且平均直徑為66.8 nm，略大于原始的HMONs。元素映射圖像也反映了RG-Mn@H 中Si、C、S、O、N和Mn元素的均勻分布（圖二g）。HMONs-CHO的BET比表面積和孔徑在經(jīng)過(guò)藥物加載、隨后的GOD修飾和RGD連接后表現(xiàn)出明顯的減小。逐步改變的Zeta電位進(jìn)一步證明了RG-Mn@H的成功合成（圖二d）。

圖二 RG-Mn@H 納米催化劑的表征。（a）HMONs納米粒子的TEM圖像。（b）HMONs的29Si和（c）13C譜。（d）HMONs，HMONs-NH2，HMONs-CHO的zeta電位和（e）紫外-可見(jiàn)吸收光譜。RG-Mn@H的（f）TEM圖像和（g）硅、硫、氧、錳、碳、氮的元素映射mapping圖。

進(jìn)一步評(píng)估RG-Mn@H對(duì)TME的重構(gòu)能力及體外療效。為了深入了解其細(xì)胞內(nèi)吞行為，選擇αvβ3過(guò)表達(dá)的腫瘤細(xì)胞系MDA-MB-231來(lái)評(píng)估納米催化劑的細(xì)胞攝取效率。從激光共聚焦掃描顯微鏡（CLSM）圖像中，RG-Mn@H 與G-Mn@H 組觀察到異硫氰酸熒光素（FITC）熒光信號(hào)的增加（圖三a）。另外，當(dāng)用游離RGD預(yù)處理后再與細(xì)胞孵育時(shí)，熒光強(qiáng)度相應(yīng)地降低，證明了RG-Mn@H的靶向性主要?dú)w因于表面連接的RGD與αvβ3整合素蛋白的特異性識(shí)別。流式細(xì)胞術(shù)定量進(jìn)一步證實(shí)，通過(guò)RGD修飾，這些納米顆粒的細(xì)胞內(nèi)化顯著增加（圖三b）。結(jié)果證明：納米催化劑良好的細(xì)胞內(nèi)吞作用有助于腫瘤靶向的MnCO轉(zhuǎn)運(yùn)。接著檢測(cè)不同處理后MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)H2O2水平（圖三c）。與PBS和G-Mn@H 治療組相比，RG-Mn@H 處理后的細(xì)胞內(nèi)的H2O2隨著時(shí)間的延長(zhǎng)迅速增加。RG-Mn@H組處理后的細(xì)胞內(nèi)H2O2水平（1.14 mM）比GOD組（0.82 mM）高出約1.5倍。接下來(lái)，進(jìn)一步應(yīng)用經(jīng)典的CO熒光探針（COP-1）來(lái)評(píng)估細(xì)胞內(nèi)H2O2驅(qū)動(dòng)的CO釋放。CLSM圖像顯示，R-Mn@H組未檢測(cè)到明顯的綠色熒光，而RG-Mn@H組在pH 5.0下，細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增強(qiáng)，表明細(xì)胞內(nèi)CO的可控釋放（圖三d）。RG-Mn@H在pH 7.4條件下處理的腫瘤細(xì)胞只有微弱的熒光信號(hào)，這可歸因于穩(wěn)定的納米催化劑和中性pH條件下GOD出于關(guān)狀態(tài)。因此，通過(guò)重構(gòu)TME實(shí)現(xiàn)H2O2的自供給來(lái)控制CO的釋放速率和釋放量是可行的。然后我們進(jìn)一步檢查RG-Mn@H的體外治療效果（圖三e）。在沒(méi)有葡萄糖的環(huán)境下，不同納米材料培養(yǎng)的MDA-MB-231癌細(xì)胞的存活率與對(duì)照組接近。相對(duì)而言，通過(guò)RG-Mn@H與葡萄糖進(jìn)行治療，細(xì)胞死亡率顯著（86.8%）。這一結(jié)果表明，葡萄糖是達(dá)到預(yù)期治療效果所必需的。同時(shí)發(fā)現(xiàn)RGD修飾的納米催化劑可以增強(qiáng)對(duì)癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性，這是由于主動(dòng)靶向效應(yīng)αvβ3-RGD的特定識(shí)別。同時(shí)，細(xì)胞毒性與RG-Mn@H的濃度以及pH值密切相關(guān)。此外，鈣黃綠素-AM/PI染色試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證治療效果（圖三f）。

圖 三 （a）不同處理后MDA-MB-231細(xì)胞的共焦熒光圖像。所有比例尺都是50 μm。Ⅰ: PBS；Ⅱ: FITC-G-Mn@H (20 μg/mL）；Ⅲ: FITC-RG-Mn@H (20 μg/mL）；Ⅳ: FITC-RG-Mn@H (20 μg/mL）+ 游離RGD；（b）不同處理后MDA-MB-231細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析；（b, c）不同處理后MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)H2O2含量的變化。（d）用COP-1型CO熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)CO含量（[Mn]:10μg/mL）。（e）不同處理后MDA-MB-231細(xì)胞相對(duì)存活率（[Mn]:10 μg/mL）（f）不同處理后鈣黃綠素-AM和PI共染細(xì)胞的共聚焦圖像。

最后，研究人員對(duì)采用MDA-MB-231乳腺癌模型進(jìn)行評(píng)價(jià)RG-Mn@H的腫瘤治療效果。小鼠隨機(jī)分為五組：PBS組，RG@H，R-Mn@H，G-Mn@H，和RG-Mn@H。 在整個(gè)治療期間監(jiān)測(cè)腫瘤體積和體重。如圖四a所示，采用RG@H治療對(duì)腫瘤生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用（抑制率為28.6%）。而單獨(dú)使用R-Mn@H的小鼠也僅僅得到一定的靜置（抑制率35.5%）。相比之下，G-Mn@H 治療抑制效果更為顯著（抑制率66.7%）。最顯著的應(yīng)該是協(xié)同納米治療組（RG-Mn@H），其在治療期間有顯著的抑瘤作用（抑瘤率94.3%）。通過(guò)測(cè)定各組代表性小鼠的腫瘤重量和相應(yīng)的數(shù)碼照片進(jìn)一步證實(shí)RG-Mn@H獲得了佳治療效果（圖四b）。與此同時(shí)，不同治療組的小鼠體重沒(méi)有明顯變化（圖四c），表明所有制劑引起的副作用可以忽略不計(jì)。值得注意的是，在注射后30分鐘，小鼠的血糖水平略有下降，然后自發(fā)恢復(fù)正常，而在后續(xù)治療過(guò)程中觀察到血糖水平?jīng)]有明顯變化（圖四d）。這一結(jié)果進(jìn)一步表明RG-Mn@H不會(huì)引發(fā)潛在毒性。值得注意的是，RG-Mn@H治療組的小鼠存活率明顯長(zhǎng)于其他治療組（圖四e），進(jìn)一步證明了高協(xié)同抗癌作用。為了揭示其抗腫瘤作用的生物學(xué)機(jī)制，采用蘇木精和伊紅（H&E）、TdT介導(dǎo)的dUTP生物素缺口標(biāo)記（TUNEL）和Ki-67抗體對(duì)各種治療后的腫瘤切片進(jìn)行染色（圖四f）。可見(jiàn)，RG-Mn@H處理的老鼠組，在H&E染色圖像上顯示最明顯的凋亡/壞死區(qū)，而TUNEL染色顯示腫瘤細(xì)胞凋亡水平最高。同樣地，Ki-67染色顯示腫瘤細(xì)胞的增殖抑制最明顯。

圖四 RG-Mn@H 納米催化劑的體內(nèi)抗腫瘤效果。（a）不同治療模式在治療期間的腫瘤生長(zhǎng)曲線（ n= 5）。(b）治療后第14天小鼠腫瘤重量。**P < 0.01，***P < 0.001。插圖：MDA-MB-231荷瘤小鼠的代表性照片和不同治療后小鼠切除腫瘤的相應(yīng)圖像。Ⅰ：PBS；Ⅱ：RG@H; Ⅲ：R-Mn@H；Ⅳ：G-Mn@H；Ⅴ：RG-Mn@H。（c）治療期間小鼠體重變化（n = 5）。（d） 小鼠靜脈注射RG-Mn@H后的血糖水平（n = 5）。（e）不同治療組后MDA-MB-231荷瘤小鼠2個(gè)月生存曲線（n = 5）。（f）MDA-MB-231 荷瘤裸鼠經(jīng)過(guò)不同的治療手段后腫瘤部位的 H&E、TUNEL和Ki67染色圖。比例尺：50 μm。

總結(jié)與展望：

上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院上海超聲醫(yī)學(xué)研究所（超聲醫(yī)學(xué)科）聯(lián)合上海大學(xué)報(bào)告了一種靶向/級(jí)聯(lián)納米催化劑實(shí)現(xiàn)原位可控CO釋放和有效氣體治療的“TME重構(gòu)”。作為一個(gè)范例，類似芬頓的前藥MnCO和天然GOD被同時(shí)整合到可生物降解的HMONs中來(lái)構(gòu)建RG-Mn@H納米催化劑。RG-Mn@H能夠特異性響應(yīng)TME并隨后重構(gòu)TME。當(dāng)被腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞時(shí)，RG-Mn@H 發(fā)生快速的生物降解同時(shí)打開(kāi)GOD門控開(kāi)關(guān)。隨后，GOD引起的內(nèi)源性葡萄糖消耗的級(jí)聯(lián)反應(yīng)不僅對(duì)腫瘤細(xì)胞的饑餓治療有顯著的作用，而且還通過(guò)提高H2O2水平來(lái)重構(gòu)TME。RGD修飾的納米催化劑具有良好的生物相容性、固有的腫瘤特異性生物降解性和協(xié)同抗癌作用，為αvβ3整合素高表達(dá)的惡性腫瘤的靶向、高效氣體治療提供了一種新的思路。同時(shí)作為智能納米平臺(tái)的例子，RG-Mn@H具有重構(gòu)TME以增強(qiáng)納米治療效果的特定能力。

論文信息：

Biodegradable cascade nanocatalysts enable tumor-microenvironment remodeling for controllable CO release and targeted/synergistic cancer nanotherapy

JianrongWu，ZheyingMeng，AgataA.Exner，XiaojunCai，XueXie，BingHu，YuChen，YuanyiZheng，

Biomaterials 

DOI：10.1016/j.biomaterials.2021.121001

原文鏈接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0142961221003574